Steemit-Italia STEM| CLP290: un nuovo farmaco per guarire dalla paralisi da lesione midollare

Introduzione

Il midollo spinale costituisce l'asse nervoso dell'essere umano, in grado di permette il movimento del nostro corpo, percepirlo nello spazio e avvertire sensazioni come il tatto, il caldo, il freddo ed il dolore. Come un autostrada, all'interno di esso viaggiano impulsi nervosi sia dal cervello che al cervello. Le lesioni parziali del midollo spinale, per motivi non ancora del tutti chiariti, non determinano una paralisi di un solo emilato del nostro corpo, ma di tutto ciò che è innervato al di sotto della lesione, come se fosse a tutti gli effetti una lesione completa¹. I ricercatori della Harvard Medical School di Boston sono riusciti a riattivare le funzionalità motorie in topi con midollo spinale danneggiato². CLP290 è il farmaco che riaccende un faro di speranza per tutte quelle persone che soffrono gli effetti del danneggiamento del midollo spinale.

L'autostrada nervosa

La colonna vertebrale oltre a essere il principale sostegno del nostro corpo racchiude e offre protezione al midollo spinale, quella parte importantissima del sistema nervoso che permette al nostro cervello sia di controllare il corpo e governare le funzioni dei vari organi sia di ricevere gli input sensitivi. In sezione anatomica, si possono distinguere facilmente due aree: una grigia interna a forma di "H", detta appunto sostanza grigia, ricca di dendriti, glia e vasi sanguigni, e la sostanza bianca esterna, la cui colorazione è conferita principalmente da assoni mielinizzati, ovvero ricoperti da una guaina mielinica che li isola dall'ambiente esterno.
La sostanza grigia è costituita da quattro pretuberanze: due corna anteriori impegnate nelle funzioni motorie e due corna posteriori che ricevono gli impulsi sensoriali trasferendoli al cervello.

SezioneSezione di midollo spinale: Si distingue la sosanza grigia costituita, dai corpi dei neuroni e la sostanza bianca, costituita dagli assoni dei neuroni che nell'insieme formano le fibre nervose - Immagine di Polarlys, CC BY 2.5

Molti degli infortuni della colonna vertebrale, seppur anatomicamente incompleti, risultano in una paralisi degli arti inferiori ³. Alcuni nervi infatti rimangono intatti e potrebbero ancora mediare il passaggi di segnali motori o sensitivi, ma per motivi ancora sconosciuti questo non avviene. In questi casi, la pratica più utilizzata attualmente è la stimolazione epidurale combinata con della ginnastica riabilitativa. Questa tecnica però solo in alcuni casi porta i pazienti a riacquistare la possibilità di movimenti volontari degli arti, inoltre al termine dei trattamenti terminano anche gli effetti benefici ⁴.
Durante l'ultimo decennio sono stati fatti passi importanti per la caratterizzazione dei meccanismi molecolari che regolano la trasmissione nervosa a livello neuronale, portando allo sviluppo di molecole, usate a scopo farmaceutico, che influenzano proteine o complessi proteici importanti per le funzioni regolatrici.

I ricercatori hanno quindi deciso di testare la capacità di alcuni di questi composti nel riattivare la funzionalità di quei nervi intatti che al livello della lesione non sono più operativi, definiti per l'appunto "dormienti"

La molecola miracolosa

Nello studio condotto alla Harvard Medical School di Boston, sono stati utilizzati topi con due lesioni spinali: una all'altezza della vertebra toracica T7 e una al livello della vertebra T10. La lesione al livello T7 è stata provocata sul lato destro e si estende oltre la linea mediana della colonna (quindi l'infortunio è profondo oltre la metà della colonna) mentre la lesione sulla T10 è stata provocata sulla parte destra della colonna e si ferma prima della metà (fig.1). Mentre la lesione T7 è stata utilizzata per ricreare un infortunio di tipo incompleto, la lesione T10 è stata provocata per ricreare una lesione di tipo completo. In questo modo infatti, i nervi discendenti non hanno una continuità e gli impulsi che originano dal cervello sono impossibilitati ad arrivare nella parte finale del midollo spinale.

I topi con tali lesioni mostrano una paralisi permanente e per lo più completa: durante le 10 settimane infatti hanno mostrato solo raramente movimenti degli arti inferiori confermando che il tratto tra T7 e T10, che governa gli arti inferiori, era dormiente. Un'ulteriore conferma è stata ottenuta mediante immunoistochimica, una procedura che permette di "colorare" certi tipi cellulari solo in determinate condizioni. Per l'immunoistochimica è stato utilizzato un anticorpo marcato anti-5HT in grado di identificare e legare i neuroni serotoninergici attivi. Utilizzando questo modello sono state testate 7 molecole, scelte in base alla loro capacità di modulare l'eccitabilità neuronale. Tra queste la molecola CLP290 è stata in grado di ripristinare la funzionalità parziale degli arti inferiori già dopo sole 4-5 settimane e una funzionalità significativa dopo 7 settimane. La funzionalità muscolare è stata valutata mediante la Basso mouse scale (BMS)⁵. Test che assegna uno score alla funzionalità utilizzando vari parametri. Tramite elettromiografia, un test che consiste nella stimolazione dei nervi periferici con stimoli elettrici per registrare le risposte sui muscoli interessati da quel nervo, è stato possibile osservare che muscoli non funzionali nei controlli (i topi non trattati) riacquistano abilità di rispondere agli stimoli nei topi trattati.

In tutto, fino all'80% dei topi trattato con CLP290 hanno dimostrato durante la camminata di poter posizionare correttamente le zampe posteriori e di poter in parte sostenere il peso del corpo. Inoltre la CLP290 è risultata efficace fino a 2 settimane dopo il termine del trattamento.

Il meccanismo d'azione

CLP290 è un farmaco attivatore di una proteina recettore, KCC2, che modula la trasmissione dell'impulso nervoso. KCC2 agisce principalmente nei neuroni inibitori e per motivi ancora ignoti è scarsamente sintetizzata nel tratto del midollo spinale oltre la lesione. La deregolazione della proteina è stata associata a una maggiore attività dei neuroni inibitori, la sua funzione infatti è quella di attenuare la loro attività. I ricercatori hanno quindi ipotizzato che un’attivazione anomala di quest'ultimi comporta l'inibizione dei neuroni coinvolti nella trasmissione dell'impulso motorio rendendoli dormienti.

La sua deregolazione però può essere contrastata da un maggiore segnale di attivazione. Infatti CLP290 induce la poca KCC2 prodotta ad essere più attiva sopperendo, almeno in parte, alla sua scarsità.
Per consolidare l'ipotesi del coinvolgimento della proteina KCC2 sono stati utilizzati topi transgenici. In questi topi la sintesi della proteina KCC2 può essere indotta e potenziata nei neuroni inibitori in maniera specifica e in qualsiasi momento dagli sperimentatori. A differenza degli esperimenti precedenti, dove il deficit di KCC2 veniva ripristinato andando a potenziare la sua attività tramite CLP290, in questi modelli è stato ripristinato aumentando la sua sintesi quindi il numero di proteine recettori totali. Il risultato ha confermato il coinvolgimento diretto della proteina KCC2. Infatti ripristinando la sua sintesi, dopo 2 settimane il movimento dei topo è risultato essere migliorato di molto. Il movimento può essere osservato nella schematizzazione nell'immagine sottostante.

Tramite microscopia a fluorescenza è stato possibile ottenere un'ulteriore conferma che la riattivazione dei neuroni oltre il tratto dell'infortunio è associabile a una maggiore attività di KCC2. Similmente al precedente caso, anche qui il deficit funzionale viene contrastato tramite una maggiore produzione della proteina recettore KCC2 nei topi transgenici. Per eseguire la microscopia a fluorescenza è necessario però un ulteriore step. Infatti la proteina recettore KCC2 viene fatta sintetizzare dal topo transgenico in associazione con un’altra proteina, la Green Fluorescent Protein (GFP) alla quale rimane legata formando una proteina chimerica, la KCC2-GFP. La GFP è una proteina in grado di diventare fluorescente al buio dando modo di localizzare la sua posizione e di conseguenza quella di KCC2 qualora venga prodotta (fig 2). Affinché la proteina chimera KCC2-GFP possa essere prodotta, possono essere utilizzate varie tecniche con efficienze diverse. I ricercatori ne hanno utilizzate tre differenti: ChAT-Cre, Vglut2-Cre e Vgat-Cre, su altrettanti gruppi di topi, A, B e C rispettivamente.

Colorazione con GFP di neurone murino - Immagine di Iguz, CC BY-SA 4.0

Su questi topi sono stati effettuati anche dei test di BMS per valutare il recupero funzionale. Da questi test è risultato che il gruppo C, dove l'efficienza di produzione della proteina chimera KCC2-GFP è maggiore, ha ottenuto dei punteggi nettamente migliori.

Applicazioni future

Tramite questa ricerca è stata scoperto il ruolo centrale della proteina KCC2, come la sua funzione si integra nel complesso meccanismo di trasmissione dei segnali nervosi e come poterla riattivare.
Dato che, come introdotto a inizio articolo, la maggioranza degli infortuni al midollo spinale nell'uomo non comporta un'interruzione completa dei nervi, questi risultati suggeriscono che ulteriori studi di approfondimento sulla molecola CLP290 come trattamento terapeutico sono necessari. Gli autori della ricerca suggeriscono che, ragionando nell'immediato futuro, sarà importante studiare ad esempio la combinazione della molecola CLP290 con altri trattamenti terapeutici.

Nonostante tutto, bisogna far presente che non tutte le funzionalità degli arti inferiori sono state ripristinate nei modelli murini. È per questo che i risultati di questa ricerca mettono in luce anche la necessità di nuovi studi che avranno il compito di approfondire i meccanismi di deregolazione di KCC2 e la scoperta di nuovi farmaci in grado di poter stimolare in maniera più efficace la sua azione.

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Scritto da:	@ginlucks
	Dottorando in biochimica e biologia molecolare, svolge ricerche di bioinformatica in campo oncologico. Tra le sue passioni l'informatica, i videogiochi e la kick boxing. Su Steemit scrive articoli riguardanti vari rami del settore scientifico con un focus sulla biologia, l'astronomia e le novità in questi campi.

Bibliografia

1. Waters RL et al. "Definition of complete spinal cord injury, in Spinal Cord" Nature vol. 29, nº 9, November 1991, pp. 573–581, DOI:10.1038/sc.1991.85, ISSN 0031-1758 (WC · ACNP), PMID 1787981.
2. Chen B et al. "Reactivation of Dormant Relay Pathways in Injured Spinal Cord by KCC2 Manipulations". Cell. 2018 Jul 26;174(3):521-535.e13. doi: 10.1016/j.cell.2018.06.005. Epub 2018 Jul 19.
3. Fawcet et al. "Guidelines for the conduct of clinical trials for spinal cord injury as developed by the ICCP panel: spontaneous recovery after spinal cord injury and statistical power needed for therapeutic clinical trials." Spinal Cord. 2007 Mar;45(3):190-205. Epub 2006 Dec 19.
4. Angeli C et al. "Reply: No dawn yet of a new age in spinal cord rehabilitation."" Brain. 2015 Jul;138(Pt 7):e363. doi: 10.1093/brain/awu376. Epub 2014 Dec 30.
5. Basso DM et al. "Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains."" J Neurotrauma. 2006 May;23(5):635-59.