多顺反子表达元件

如何同时表达多个基因呢？
多个质粒混合起来转染：随着混合质粒的种类增多，随机性就越大，不能保证每个细胞都获得了等量的每种质粒。

使用多个启动子，将各个“启动子-ORF”拼接策略，存在两个问题：一是启动子的个头不小（如常用的CMV启动子超过500 bp，EF1α启动子超过1.1 kb），多个启动子会导致载体显著增大，可能会给后续的实验带来麻烦；二是强启动子太多，容易给宿主细胞带来代谢负担，换用弱启动子，表达丰度不够。而如果想实现外源基因的串联表达——也就是说，前一个基因表达，势必引起后一个基因表达——那么多启动子的策略并不可行。

多顺反子元件近乎完美地解决了上述问题。单顺反子，意思就是这段DNA中，含有编码单一蛋白的基因。而多顺反子（Polycistron或Multicistron），顾名思义，就是这段DNA中含有编码多个蛋白的基因。多顺反子常常存在于原核生物中，一个转录本，可以翻译出多个蛋白。而真核生物，则多利用单顺反子策略。

在分子克隆中，我们可以利用原核生物的这一特点应用于真核生物之中，即使用多顺反子元件载体，将多个ORF串联起来，同时表达多个基因。其中，IRES元件和2A多肽元件是最常用也是最容易使用的。

IRES——Internal Ribosome Entry Site（内部核糖体进入位点）
mRNA的翻译，依赖于核糖体的结合，并识别起始密码子，沿着5’→3’端进行。但是，起始密码子序列（比如AUG）在一个转录本中是广泛存在的，那核糖体又是如何认得最最开始的那个AUG序列呢？其实道理很简单，在真核生物中，绝大多数转录本的翻译，同时还依赖于5’端的一个特殊结构，简称为“帽子”（cap）。只有识别到cap，核糖体才会结合到mRNA，扫描起始密码子，从而继续后续的翻译进程。

然而，真核生物还有一小部分基因的翻译，可以不依赖于cap。其中研究最为深入的，便是IRES依赖通路。IRES是一个相当古老的基因元件，最早在脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）中发现，在部分真核生物的基因（如某些生长因子，甚至某些原癌基因）中也存在。IRES为核糖体在转录本的内部提供了一个新的“落脚点”。即使不存在cap， 核糖体也能与之结合，并扫描起始密码子。

如今，IRES成为多个基因串联表达的实用工具。它最大的优点是，后一个基因的ORF并不需要和前一个基因的ORF同框，因为核糖体会重新扫描后一个基因的起始密码子，而不依赖于前面的ORF结构。这样一来，克隆工作就简单得多了。

但是，IRES也有很明显的缺陷。一是这个元件的块头也不小（500-600 bp），二是后一个基因的表达强度，往往低于前一个基因。

2A多肽元件（2A peptide）
和IRES元件一样，2A多肽元件也最早在病毒中发现（小RNA病毒，Picornavirus），且直到目前为止，仅在病毒中发现。而尽管真核生物基因组中并不存在2A，但2A介导的多顺反子表达却广泛存在。（注：目前为止，尚未发现原核生物中存在2A介导的多顺反子表达途径。）

2A元件是一类编码约仅有20个氨基酸多肽的序列（如下图所示），它能阻止翻译过程中氨基酸形成共价键，并维持翻译继续进行。这样一来，翻译产物就被“切了一刀”，变成两段（比较正式的叫法是“顺式水解反应”，或者说“自切割”）。2A元件的共有序列是D(V/I)ExNPGP。其中，x是任意氨基酸，而“下刀”切割的位点，就在最后两个氨基酸G和P之间。

除了上图明示的序列外，在2A元件的5’端加上编码GSG三肽的序列，可以显著提高切割效率
2A多肽元件用于多基因串联表达，具有IRES无可比拟的优势。第一，2A非常短，克隆甚至直接合成非常方便。第二，在理想情况下，2A介导的自切割效率几乎是100%。这也是目前为止唯一能够保证串联基因等量表达的策略。

但是，2A多肽元件也是有缺点的。首先，前一个蛋白的C端会多了一小段外源多肽，后一个蛋白的N端也会多一个脯氨酸（Proline）。虽然在绝大多数情况下，这不会影响蛋白质的功能。但有时候运气不好起来，什么事情都有可能发生，做实验的人都懂。其次，后一个ORF要和前一个ORF同框（貌似这不算是什么缺点），否则就姨妈（雾——移码了）。最后，不同的2A多肽，在不同物种甚至细胞种类之间的切割效率是不一样的（有的能接近100%，有的可能只有50%）。

此外值得注意的是，当要串联表达3个以上蛋白时（即使用2个以上2A多肽元件），请注意使用不同种类的2A来间隔ORF。否则重复出现相同的序列，在脸不好看的情况下，可能会导致一些奇怪的重组现象。